Tuberculosis bovina para estudiantes y profesionistas: diagnóstico, prevención y control

Saludos amigos, en esta entrada trataremos el diagnóstico de la tuberculosis bovina, mencionaremos varias técnicas diagnósticas que se pueden utilizar para esta enfermedad y detallaremos algunos aspectos del diagnóstico por histopatología, aislamiento bacteriológico y reacción en cadena de polimerasa simple, que son las técnicas más utilizadas. Espero que les resulte útil y que tengan la amabilidad de citarme:

Herrera, L. B. Comparación de histopatología, asilamiento bacteriológico y reacción en cadena de polimerasa simple en el diagnóstico de tuberculosis bovina. Tesis de Licenciatura, Universidad Autónoma de Chiapas.

Las páginas son:
Diagnóstico: 27- 42
Prevención y control: 42- 43

9. Diagnóstico.

Tuberculinización

La Norma Oficial Mexicana NOM-031-ZOO-1995 establece el uso de técnicas de campo, conocidas como pruebas de tuberculina. Se administran 0.1 mL de derivado purificado de proteína (PPD), de M. bovis por vía intradérmica en el pliegue caudal. Cuando un animal tuberculoso es expuesto por segunda vez al PPD desarrolla una respuesta de hipersensibilidad de tipo IV, mediada por linfocitos T específicos, de manera que se presenta una inflamación en el sitio de inyección, una zona elevada, enrojecida y endurecida que desaparece a medida que el antígeno se degrada. Se lee la prueba a las 72 horas y se interpreta como negativa, sospechosa o positiva dependiendo del tamaño de la zona inflamada. Todo animal reactor o positivo es sometido a la prueba de intradermorreacción cervical simple y de ser necesario se somete a la doble comparativa (o cervical comparativa) para la cual se utilizan los derivados purificados de proteína del M. bovis y M. avium. Se rasuran dos áreas de piel en el cuello del animal separados por 5 cm y se inyecta un PPD de M. bovis en un área rasurada y una PPD de M. avium en la otra la reacción es la misma que en la prueba de intradermorreacción en el pliegue caudal.

La prueba de tuberculina tiene como ventaja que es una prueba muy barata, pero posee algunas desventajas, entre ellas que a los animales que son inoculados no se les puede repetir la prueba hasta después de 60 días por anergia inmunológica inducida por la misma prueba. La eficacia de la prueba de tuberculina depende de factores tales como la potencia del PPD utilizado, la correcta aplicación y la capacidad de respuesta del animal infectado. En diferentes estudios en el campo se ha determinado una sensibilidad de la prueba entre el 77-95%. Falsos negativos ocurren en animales viejos, animales que han parido recientemente, animales en el estado inicial o final de la misma enfermedad, animales infectados con otros agentes patógenos ya sean estas infecciones virales, infecciones con otras micobacterias u hongos y algunas helmintiasis severas o en animales en estado caquéctico. La especificidad de la prueba en general es alta, alrededor de 98%, sin embargo, se han reportado valores entre el 75%-95%. Infecciones debidas a otras micobacterias del ambiente, así como bacterias de la familia Actynomicinae, interfieren con la prueba, debido a la existencia de antígenos comunes entre ellos.

Serología

La serología se utiliza para detectar el IFN-γ por medio de una Inmuno-ensayo ligado a enzimas (ELISA) indirecta en la que se incuba sangre completa de bovinos sospechosos de tuberculosis con un anticuerpo anti-IFN-γ. Si el animal ha estado en contacto con el microorganismo, sus linfocitos liberarán IFN-γ, el cual será detectado a través de ELISA, en el que los anticuerpos anti-IFN-γ capturan el IFN-γ bovino. Un anticuerpo específico anti-IFN-γ conjugado a una peroxidasa, reacciona produciendo color.

Posteriormente las placas en las que se lleva a cabo la reacción antes mencionada, se coloca en el espectrofotómetro de lectura de placas o lector de ELISA que mide la densidad óptica (DO) de la reacción. Una DO mayor a 0.100 se considera sospechosa y es positiva cuando supera los 0.300.

Es posible practicar la ELISA de IFN-γ utilizando un conjugado de ESAT-6:CFP-10, purificado o recombinante, o bien un conjugado ESAT-6:PPD-M, de manera que aumente la intensidad de la respuesta de IFN-γ, así como la sensibilidad y especificidad.

La técnica de ELISA de IFN-γ tiene ciertas vulnerabilidades, entre ellas que la intensidad de la reacción de IFN-γ se modifica de manera impredecible en animales con helmintiasis graves, aunque también se ha encontrado que la diferencia en reactividad entre animales se debe a la diversidad en los antígenos linfocitarios bovinos (BoLA) que existen en algunas razas. Una respuesta inmunosupresiva puede esperarse tras la inyección de PPD en varias ocasiones. Asimismo, el tipo de explotación a la que se somete al bovino puede afectar la lectura de la prueba, ya que estas representan diferencias en la exposición a un ambiente con micobacterias, siendo la producción tipo extensiva la que modifica en mayor grado la reacción de IFN-γ.

Asimismo la técnica de IFN-γ, al igual que la tuberculina puede presentar falsos positivos o cuando se presentan infecciones duales con otras micobacterias.

Recientemente se ha expuesto la necesidad de técnicas de campo más confiables, entre ellas el uso de cócteles peptídicos de ESAT-6 recombinantes conjugados con tuberculina, con el fin de mejorar la especificidad de la tuberculina, y además detectar animales recientemente infectados. Generalmente los conjugados antigénicos se utilizan para evaluarse posteriormente con ELISA de IFN-γ. La respuesta de ON y TNF-α también son detectadas por ELISA y por inmunoblot. La detección de TNF-α junto a la de IFN-γ pueden mejorar la especificidad más que la detección de ON, dado que esta respuesta es variable según la raza del animal infectado y la cepa infectante.

Otra técnica propuesta es la aglutinación en gotas de látex. Esta técnica consiste en agregar el antígeno ESAT-6 a gotas de látex, cubiertas por una solución de sujeción de fosfatasa alcalina. Estas gotas se exponen a suero bovino, si este contiene la IgG específica de ESAT-6 esta se aglutinará con la gota de látex impregnada con el antígeno.

La técnica más recientemente descrita es la conocida como inmunocromatografía o técnica de flujo lateral, cuyo uso se propone para la detección de respuestas séricas de MP83, MP70, ESAT-6 y CFP-10. Esta técnica utiliza una modificación de la aglutinación en gotas de látex. Por fuerzas capilares, los complejos de aglutinación fluyen lateralmente a través de las membranas de nitrocelulosa impregnada de antígeno, fijando el antígeno inmovilizado en las gotas de látex de manera que se produce una banda de color azul.

Examen directo.

Consiste en centrifugar líquidos corporales (aspirados torácicos, abdominales, orina, exudados traqueobronquiales). Si el exudado es fibrinoso, se pasa a digestión con hidróxido de sodio al 0.4% estéril durante 45 minutos. Posteriormente se desinfectan con hipoclorito de sodio para eliminar microorganismos que no sean micobacterias. Los frotis del sedimento o los tejidos se tiñen con colorantes acidorresistentes (Ziehl- Neelsen) o con auramina- rodamina cuando se dispone de microscopio de fluorescencia. La muestra se considera positiva cuando se encuentran más de diez bacilos por campo.

Inspección en rastro.

Los animales positivos a las diferentes pruebas de tuberculinización o, en dado caso, a la prueba de IFN-γ, son marcados con una T en la mejilla izquierda y se sacrifican al final de la jornada. En ciertos casos pueden encontrarse animales negativos a las técnicas de campo convencionales, con lesiones sospechosas. Estas lesiones pueden ser discretas y focales con necrosis y exudado purulento o lesiones graves, difusas con exudado caseoso amarillento y diversos grados de calcificación. Todas las lesiones sospechosas se envían a los laboratorios de diagnóstico animal en dos partes: una porción laminada y contenida en formol al 10% en una proporción de 1:10 y otra mitad no laminada en borato de sodio en proporción 1:1.

Histopatología y aislamiento.

Los tejidos con lesiones sospechosas, principalmente nódulos linfáticos y pulmones, se envían en formol al 10% a laboratorio en proporción 1:10. Se realiza el corte con microtomo y la tinción del tejido fijado con Hematoxilina-Eosina y Ziehl-Neelsen, posteriormente se analizan los tejidos con microscopía óptica. Puede observarse fibrosis, zonas necróticas claramente definidas, células gigantes con núcleos en formación semilunar o de herradura, zonas de calcificación. En los cortes teñidos con Ziehl-Neelsen se observan bacilos ácido-alcohol resistentes de color rojo magenta. Se describen como negativo, compatible o sugestivo dependiendo de los hallazgos.

De acuerdo a la Norma Oficial Mexicana NOM 031- ZOO- 1995, el diagnóstico por histopatología debe confirmarse por bacteriología, las muestras deben llegar al laboratorio en un frasco de boca ancha inmersas en borato de sodio en proporción 1:1. Las muestras no deben estar laminadas ni con sangre y de preferencia sin tejido adiposo. El aislamiento bacteriológico se realiza en un medio como el Stonebrink e incubadas a 37° C durante 9 semanas. La tipificación se realiza con resiembras de las colonias aisladas en medio de Stonebrink, estas resiembras se someten a temperaturas de 22, 37 y 45° C y posteriormente se realizan pruebas bioquímicas como catalasa, nitrato y niacina.

Condiciones que afectan el estudio histopatológico.

Entre estos el más frecuente es que la muestra no se remita al laboratorio con un laminado adecuado, esto puede dificultar que la muestra se fije bien y causa algunos problemas en el procesamiento histológico. Otra condición de importancia es el tiempo que transcurre entre el momento en que se toma la muestra y el que se coloca en formol. Si la cantidad de formol no se presenta en la proporción 1:10 ni en la concentración necesaria, el tejido no se fijará adecuadamente. Todo lo anterior genera cambios de importancia en el tejido que alteran la lectura de las laminillas.

Condiciones que afectan el aislamiento bacteriológico.

Una mala proporción de conservador representa un problema frecuente. Si la proporción de borato de sodio es menor a la de la muestra, podría disminuir la viabilidad del bacilo, es sufre un proceso de desvitalización.El aislamiento bacteriológico es muy vulnerable a la contaminación de las muestras, dado que se presenta una competencia entre el M. bovis y otros microorganismos, particularmente si desde que la muestra fue enviada, esta contiene pelo, sangre o heces. La cronicidad o la severidad de las lesiones también generan problemas al aislamiento bacteriológico. Si la proporción de borato es mayor, esto causa un grado mayor de deshidratación del tejido, en especial si la muestra está laminada. Cualquiera de las situaciones antes mencionadas genera condiciones que disminuyen la viabilidad del bacilo. Además el aislamiento bacteriológico puede verse vulnerado por la calidad del huevo que se utiliza como ingrediente del medio de Stonebrink, el huevo debe ser fresco y de preferencia de gallina de traspatio a fin de evitar inhibición de crecimiento, debido a que a estas gallinas no se les administran antibióticos.

Cromatografía Líquida de Alto Rendimiento.

La técnica de Cromatografía Líquida de Alto Rendimiento examina el tiempo de elución y retención relativa de los ácidos micólicos. Para ello se requiere la saponificación de estos ácidos. Los ácidos micólicos se visualizan con rayos ultravioleta a 254nm de longitud de onda.Con esta técnica M. bovis presenta elución en 5 minutos con 35 segundos.

Cromatografía Líquida en Capa Delgada.

Los ácidos micólicos son α- alquil, β - hidroxiácidos de alto peso molecular, que se encuentran en la pared celular como componentes característicos de las micobacterias. La técnica de Cromatografía en capa delgada consiste en extraer los ácidos micólicos de colonias cultivadas. Con esta técnica se detecta un patrón característico de M. bovis, que incluye α- micolatos, metoximicolatos y cetomicolatos, este patrón difiere del patrón de M. tuberculosis dado que carece de hidroximicolatos.

Reacción en Cadena de Polimerasa.

La PCR utiliza el fenómeno de replicación semi conservativa del ADN y la repite bajo condiciones específicas hasta obtener una o varias secuencias específicas de nucleótidos “ millones de veces. Es necesario extraer el ADN de las muestras de tejido, macerando las muestras y posteriormente someterlas a proteólisis. El ADN se purifica y se mezcla con “iniciadores” o “primers” que son secuencias sintéticas de hebra sencilla, de hasta 30 nucleótidos. Cuando el ADN se desnaturaliza, las porciones de ADN que sean las mismas bases nitrogenadas que los iniciadores, si las hay, se aparearán con estos iniciadores, de manera que se forman millones de secuencias específicas de ADN. El primer paso es conocido como desnaturalización del ADN el cual se lleva a cabo a 95° C. Posteriormente se realiza la alineación, en el cual los inciadores y las secuencias de nucleótidos que les corresponden se encuentran y se alinean o aparean, la temperatura necesaria para alinear (temperatura de apareamiento o Tm) los iniciadores varía y es específica para cada iniciador y puede variar desde 60 a 68° C, este pasos debe repetirse desde 15 hasta 90 veces dependiendo de la eficiencia del proceso y del iniciador. El último paso, denominado extensión que se realiza a 72° C, en el que se alargan los inciadores y se exponen las bases nitrogenadas y se unen en el orden necesario. El producto de PCR se coloca sobre un gel de agarosa previamente teñido con bromuro de etidio y se somete a electroforesis. Las secuencias se movilizan atraídas por la electricidad, moviéndose a una cierta distancia dependiendo de su peso molecular, se agrupan y se observan en una cámara de luz ultravioleta. Si aparecen las marcas de las secuencias de nucleótidos y encajan con las marcas que producen los iniciadores, se lee como positivo, pues la especie que se busca se manifiesta.

La secuencia de inserción (IS) 6110 se utiliza ampliamente para detectar a las especies del complejo Mycobacterium tuberculosis debido a que presenta un alto grado de conservación entre las micobacterias del complejo M. tuberculosis. Además de que el tamaño de este segmento de inserción, 125 pares de bases, puede facilitar su amplificación cuando las muestras clínicas son expuestas a condiciones que fragmentan el ADN.

Sin embargo la amplificación de esta secuencia de inserción puede dar lugar a la detección de más de una especie de micobacteria. Por esta razón se amplifican por PCR las regiones oxyR y pncA, que presentan un polimorfismo en la región 285 y 169 respectivamente, lo que puede ser útil para diferenciar M. bovis de M. tuberculosis. De igual manera el fragmento mtp40 puede estar ausente en algunas cepas de M. tuberculosis y causar un falso positivo si existiera una muestra infectada una de estas cepas. Para evitar esto y a la vez discriminar de M. avium, M. microti y M. africanum se utiliza la amplificación de un gen de 500 pares de bases de la región oxyR con los iniciadores JB 21 y JB 22. La región oxyR codifica proteínas relacionadas con la resistencia al estrés oxidativo y los iniciadores JB 21 y JB 22 se diseñaron para ser altamente específicos para M. bovis.

Diagnóstico diferencial.

Varias enfermedades se pueden confundir con tuberculosis, sobre todo en el rastro debido a similitudes en las lesiones, entre ellas destacan: actinobacilosis, actinomicosis, nocardiosis, paratuberculosis, criptococosis, coccidiodomicosis e histoplasmosis, así como neoplasias, particularmente carcinomas y adenomas.

La nocardiosis puede diferenciarse de tuberculosis por M. bovis mediante la observación al microscopio porque Nocardia asteroides es más corto que el M. bovis y además es Gram positivo. Asimismo N. asteroides forma hifas rudimentarias o filamentos ramificados que se fragmentan en formas cocoides y bacilares, mientras que M. bovis forma filamentos o cordones. Otras técnicas para diagnóstico diferencial incluyen la fijación de complemento, Inmunodifusión en gel de agar (AGID) y ELISA.

La actinomicosis se puede diferenciar de la tuberculosis por medio de histopatología porque la lesión principal es un piogranuloma, en la que los neutrófilos se encuentran al centro de la necrosis y están rodeados por macrófagos. Además se presentan estructuras bacterianas radiadas eosinofílicas intralesionales negativas a Zielh-Neelsen y Gram positivas. Otras técnicas para diagnosticar esta enfermedad son: aislamiento bacteriológico, inmunohistoquímica, seroaglutinación, fijación del complemento, inhibición de la hemoaglutinación, neutralización de la toxina y AGID.

La actinobacilosis se puede diferenciar de tuberculosis con histopatología por características muy similares a las que causa Actinomyces bovis. Asimismo la actinobacilosis se caracteriza por presentar una extensa fibrosis, notablemente mayor a la que se presenta en la tuberculosis bovina.

Cryptococcus neoformans puede diferenciarse por histopatología porque se observan macrófagos vacuolados que contienen cuerpos levaduriformes, ovoides o esféricos de 5 a 10 μm, de pared gruesa. Estas estructuras se evidencian mejor por la tinción de Ácido Peryódico de Schiff (PAS) o Grocott. Asimismo, también se observan grupos de neutrófilos alrededor de los cuerpos levaduriformes libres en el tejido.

A su vez, las lesiones causadas por Histoplasma capsulatum cuando se observan al microscopio, suelen presentar un alto grado de calcificación, así como fibrosis que se distribuye de manera concéntrica alrededor del foco necrótico, formando un granuloma bien definido.

Dentro de algunos macrófagos pueden observarse estructuras redondas y pequeñas, de 2 a 4 μm con la zona central teñida, con un halo alrededor que parece encapsularlas. Se observan mejor con PAS o Grocott

Las lesiones causadas por Coccidiodes immitis se observan al microscopio como piogranulomas similares a los que se presentan en actinobacilosis/actinomicosis, pero se pueden observar las esférulas del hongo, las cuales miden cerca de 50 μm y las características como endosporas y ausencia de gemas se evidencian por tinción de PAS.

Algunas neoplasias como adenomas, adenocarcinomas y linfomas se remiten con frecuencia a los laboratorios para su diagnóstico, sospechándose de lesiones tuberculosas, dado que algunas neoplasias macroscópicamente presentan aspecto granuloso, endurecimiento o calcificaciones y necrosis caseosa. Un adenoma es una neoplasia epitelial benigna que deriva de una glándula aunque no necesariamente repite los patrones glandulares. Puede observarse formando patrones glandulares muy estrechos similares a los de la glándula original pero con una orientación distinta.

10. Prevención y control.

En todos los países en los que la tuberculosis bovina se presenta, se implementan programas enfocados principalmente a evitar la diseminación de la enfermedad entre regiones y entre rebaños. Una de las medidas más socorridas es la detección de la tuberculosis bovina por medio de tuberculinización, el aislamiento de los animales enfermos y la restricción de transporte de estos, cuando se realizan programas de detección previas al traslado, en México estas actividades estás reglamentadas por la NOM- 031- Z00- 1995. Otra medida de control es impedir la entrada de animales de una zona con presencia de tuberculosis a una zona libre. Se exige que, en la compra de bovinos, se extienda al comprador un certificado de hato libre, en el cual se documente que a los bovinos les fue practicada una prueba de tuberculina que resultó negativa. El ejemplar que ingresa a un nuevo rebaño debe cuarentenarse y ser sometido a nuevas pruebas, el nuevo ejemplar debe eliminarse o mantenerse aislado a fin de evitar el contagio si resulta positivo a tuberculosis. La confirmación diagnóstica de los casos de tuberculosis bovina se utiliza para determinar las prevalencias locales o regionales y con base en esos datos establecer modificaciones especiales a los programas de control, por ejemplo, intensificar las campañas de tuberculinización y de concientización a los productores, así como mejorar las técnicas de diagnóstico. En algunos países de Latinoamérica, en respuesta a los planteamientos de la Oficina Internacional de Epizootias (OIE), se implementaron programas de semi despoblamiento de los rebaños, mientras que en otros se ordena el despoblamiento total y la cuarentena obligatoria por seis meses.

En algunos países, la presencia de una amplia gama de reservorios silvestres representa un riesgo de infección para los hatos ganaderos, sobre todo para aquellos que pastorean en grandes extensiones en sistemas silvopastoriles. En estos países se han puesto en marcha programas que recomiendan el uso de dispositivos mecánicos que ahuyenten a ciertas especies como alces y venados, a fin de que no contaminen los pastizales que sirven de alimento al ganado bovino o bien, que hagan uso de repelentes químicos a fin de simular un marcaje de territorio para que no se acerquen mamíferos pequeños como mapaches, hurones, comadrejas y otros mustélidos que se conocen como reservorios de M. bovis. Estos programas incluyen la vacunación de grandes masas de reservorios silvestres con cepas atenuadas o del bacilo de Calmette-Guérin (BCG), ya que en los animales vacinados con estas cepas, la excresión por vía fecal del bacilo disminuye .

Por su parte en países que tienen condiciones ambientales muy adversas, tales como sequías prolongadas que obligan a que las personas compartan las fuentes de agua con los animales, situaciones que dificultan en gran medida el control y la erradicación de la tuberculosis bovina, se ha propuesto el uso de la vacunación del ganado bovino con cepas de BCG para el control a largo plazo de la tuberculosis bovina, ya que esta vacuna disminuye la eliminación del bacilo en las heces. No obstante, en el ganado bovino vacunado las pruebas de tuberculina presentan un índice mayor de falsos positivos, de tal manera que en vez de pruebas de PPD, los veterinarios se verían obligados a utilizar agentes diagnósticos más precisos como el conjugado peptídico de ESAT- 6:CFP- 10 y la prueba de INF- γ para diferenciar entre la infección con M. bovis y la vacunación con M. bovis BCG. Además, se ha comprobado que la revacunación del ganado bovino con BCG disminuye la protección.

La referencias bibliográficas las voy a colocar en la próxima entrada, en la que hablaremos acerca de las condiciones que afectan el diagnóstico por PCR.