Tuberculosis bovina, condiciones que afectan el diagnóstico por PCR

Saludos de nuevo, amigos veterinarios, esta vez decidí dedicarle un espacio para tratar con más detalles ciertos aspectos del diagnóstico de tuberculosis bovina mediante PCR. Aunque existen métodos moleculares más sofisticados como la PCR anidada, tipificación de oligo espaciadores (spoligotyping, espoligotipeo) análisis de restricción longitud del fragmento de polimorfismo (Restriction Fragment Length Polymorphism RFLP), PCR en tiempo real, PCR multiplex, Número Variable de Repeticiones en Tándem (que alguien me explique qué diablos es tándem) (Variable Number Tandem Repeat VNTR), estos métodos suelen aplicarse más a la investigación que al diagnóstico de rutina, consideremos que son demasiado costosos para ese uso. La PCR convencional está más al alcance de muchos laboratorios de diagnóstico. El siguiente texto también se desprende de mi trabajo de tesis y está enfocado a lo que puede pasar con la PCR cuando se utilizan muestras de tejido fijado en formol y embebido en parafina, comúnmente llamadas especímenes histológicos o muestras de archivo. Sin embargo, varias de esas condiciones también pueden aplicarse a tejidos en fresco o conservados en etanol al 70%.

Espero les sea de utilidad y gracias por atender esta fuente de información.

De nuevo la cita bibliográfica es:

Herrera, L. B. Comparación de histopatología, asilamiento bacteriológico y reacción en cadena de polimerasa simple en el diagnóstico de tuberculosis bovina. Tesis de Licenciatura, Universidad Autónoma de Chiapas


La variación de resultados de PCR puede esperarse en parte debido a las adaptaciones a la técnica de PCR, necesarias para adecuarla a las condiciones de cada localidad. Asimismo es posible enumerar diversas condiciones que pueden generar que se dañe el ADN o que no se amplifique. Entre tales condiciones se mencionan la insuficiencia del método de extracción de ADN como causa de falta de amplificación y se ha observado que mejorando los métodos de extracción, los resultados mejoran notablemente. Por otro lado, también se sabe que una posible inhibición de la actividad de la polimerasa es debida a la presencia de residuos de solventes utilizados en la preparación de los bloques de tejido.
La inhibición de la actividad de la polimerasa de ADN puede presentarse por la presencia de restos tisulares y ADN proveniente del tejido y en especial de restos de las paredes micobacterianas, que debido a la resistencia de las mismas, no fueron degradadas adecuadamente durante el proceso de extracción.
El mayor potencial de daño al ADN y por lo tanto a la amplificación es la fijación prolongada en formol, ya que este material causa fragmentación y enlaces cruzados en el ADN, eventualmente se pierden bases púricas lo cual conlleva a alineación inespecífica.
Al igual que el aislamiento bacteriológico, la PCR puede verse afectada por el bajo número de bacilos presentes,
Otro punto a considerar es el fragmento a amplificar. Mientras más copias de un fragmento existan en el genoma de un organismo, mayor es la probabilidad de amplificarlo.
El fragmento IS6110 está presente en la mayoría de las cepas de las especies pertenecientes al complejo M. tuberculosis, M. bovis posee como máximo tres copias del fragmento IS6110, la mayor parte de las cepas de M. bovis posee solo una copia de dicho fragmento. Asimismo se ha reportado la ausencia del fragmento IS6110 en diversas cepas de M. bovis.
La actividad del óxido nítrico y necrosis caseosa, como parte de la respuesta del hospedero, pueden ser factores potenciales de daño al ADN micobacteriano, disminuyendo la posibilidad de amplificar dicho ADN.

La distribución irregular de los bacilos en los bloques de tejido se menciona como una posible causa de disminución de la amplificación de ADN.
Todas estas condiciones, por sí solas o en conjunto disminuyen la posibilidad de amplificar el fragmento de ADN deseado, causando consecuentemente alteraciones de la validez del diagnóstico.
Por último, la persistencia de ADN de micobacterias en tejidos sanos durante infecciones latentes se ofrece como explicación a los falsos negativos.

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De nuevo la cita bibliográfica es:

Herrera, L. B. Comparación de histopatología, asilamiento bacteriológico y reacción en cadena de polimerasa simple en el diagnóstico de tuberculosis bovina. Tesis de Licenciatura, Universidad Autónoma de Chiapas