Tuberculosis Bovina (sí, otra vez)

Hola a todos. Resulta que en estos días me he estado dedicando a traducir artículos científicos y empecé con un boletín informativo del Servicio de Inspección de Sanidad Animal y Vegetal del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos. Repito, el siguiente texto es la traducción de un boletín informativo de Servicio de Inspección de Sanidad Animal y Vegetal del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos, que lo disfruten.

La tuberculosis (TB) es una enfermedad contagiosa tanto para humanos como para animales. Es causada por tres específicos de bacterias que forman parte del grupo Mycobacterium: Mycobacterium bovis, M. avium y M. tuberculosis.

La TB bovina, causada por M. bovis, puede ser transmitida del ganado a los humanos y otros animales. Ningún organismo del grupo TB tiene un rango tan grande de hospederos como el de la tuberculosis bovina, que puede infectar a todos los vertebrados de sangre caliente. M. avium puede infectar a todas las especies de aves, así como cerdos y bovinos. M. tuberculosis afecta principalmente a los humanos pero también puede transmitirse a los cerdos, a los bovinos y a los perros.

La TB bovina ha afectado la salud humana y animal desde la antigüedad. Una vez fue la enfermedad infecciosa con mayor prevalencia en los bovinos y cerdos en los Estados Unidos, la tuberculosis bovina causó mayores pérdidas animales en los EE. UU. que las demás enfermedades infecciosas en conjunto a principios del siglo pasado. Comenzando en 1917, el Programa Cooperativo Estatal- Federal de Erradicación de la Tuberculosis, administrado por el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (USDA) y el Servicio de Inspección de Sanidad Animal y Vegetal (APHIS), agencias estatales de salud animal, y los productores ganaderos de los EE. UU., han erradicado casi por completo la TB bovina. La presencia de esta enfermedad en humanos se ha reducido como resultado del programa de erradicación, avances en sanidad e higiene, el descubrimiento de fármacos efectivos y la pasteurización de la leche.

La enfermedad

En general, las micobacterias patógenas solo pueden vivir unas cuantas semanas fuera del cuerpo del hospedero, porque no pueden tolerar la exposición prolongada al calor, luz solar directa o condiciones de sequedad. Bajo condiciones de frío, oscuridad y humedad, estos organismos pueden sobrevivir más tiempo.

Las micobacterias no crecen fuera del hospedero, a excepción de los medios de cultivo, en donde se multiplican aproximadamente cada 20 horas. Debido a esta tasa de crecimiento relativamente lenta, la enfermedad tarda usualmente varios meses para desarrollarse. En algunos casos, la enfermedad puede permanecer latente dentro del cuerpo del hospedero durante toda su vida, tanto en humanos como en animales, sin causar enfermedad progresiva.

La TB bovina es una enfermedad crónica, rara vez se observa aparente hasta que ha alcanzado un estado avanzado en bovinos, cérvidos en cautiverio y cerdos. Algunos animales infectados parecen en la mejor condición, sin mostrar signos de infección hasta que son sacrificados, momento en el que se pueden observar tan severamente lesionados durante la inspección que las canales se tienen que confiscar.

Transmisión de la TB

La TB bovina se puede transmitir de animales a humanos y viceversa. Aunque los animales jóvenes y los niños pueden contraer la enfermedad al beber leche cruda de madres infectadas, la vía más común de transmisión es a través de la respiración. Partículas invisibles (aerosol) que contienen la bacteria de la TB, son expelidas por los animales infectados por exhalación o tos y luego pueden ser inhaladas por animales o personas susceptibles. El riesgo de exposición es mayor en áreas cerradas como graneros o corrales. La inhalación de aerosoles es la ruta más común de infección para trabajadores agrícolas y veterinarios que trabajan con ganado enfermo. El ganado puede infectarse entre sí cuando comparten abrevaderos contaminados con saliva u otras descargas de animales infectados. Becerros, cerdos y humanos pueden contraer la TB bovina cuando beben leche no pasteurizada de vacas infectadas.

Diagnóstico

Las lesiones tuberculosas pueden hallarse en cualquier órgano o cavidad corporal de los animales enfermos. En las etapas tempranas de la enfermedad, estas lesiones son muy difíciles de hallar, incluso durante el examen post mortem. Pero en las etapas posteriores, los nódulos o abultamientos que produce la TB bovina se vuelven muy evidentes en los pulmones y nódulos linfáticos asociados, así como en los nódulos linfáticos de la cabeza y del tracto intestinal. Las lesiones también pueden aparecer en los órganos abdominales, reproductivos, sistema nervioso, nódulos linfáticos de la superficie corporal y en los huesos.

Los humanos y los animales tuberculosos desarrollan una respuesta inmune, la cual puede detectarse con una prueba cutánea de tuberculina. La tuberculina es un producto estéril de laboratorio hecho por cultivo de bacterias de la TB, matándolas con calor y eliminándolas de la sustancia sobre la que crecieron, diluyéndolas adecuadamente y preservando la mezcla restante. Después de 72 que se inyecta la tuberculina en los animales afectados por la TB, una hinchazón característica aparece en el sitio de inyección. Esta reacción es un resultado positivo de la prueba, indicando exposición a un tipo de micobacteria.

Otros métodos diagnósticos son necesarios para confirmar la presencia de Tb bovina. En humanos, estas pruebas incluyen rayos x de la región torácica y cultivos de esputo. Para los animales se utilizan: la prueba de tuberculina cervical comparativa, pruebas serológicas, examen post mortem y otros procedimientos de laboratorio.

El tratamiento de la TB bovina en humanos lleva de 6 a 9 meses y su tasa de éxito es de 95%. En el ganado, la TB bovina se puede controlar dentro de un hato infectado a partir de la aplicación regular de pruebas de tuberculina y sacrificio de cada animal positivo a las pruebas, hasta que el hato entero resulte negativo a las pruebas. Sin embargo, debido a que no existe un método que asegure que la TB bovina ha sido eliminada de un hato afectado, el APHIS recomienda el despoblamiento del hato.

Control y Erradicación

La manera más efectiva de manejar el problema de la TB bovina en humanos es erradicarla en el ganado. Al inicio del programa de erradicación cooperativo a principios del siglo pasado, todos los hatos bovinos fueron probados sistemáticamente y todos los reactores fueron sacrificados. Las agencias federales y estatales compartieron los gastos en el pago de indemnizaciones. Los establos se limpiaron y desinfectaron después de la salida del ganado infectado. Como resultado de este programa, la tasa de reactores en el ganado bovino se redujo de cerca del 5% a la actual tasa menor al 0.02%. Como resultado de esto, la incidencia de la TB humana causada por M. bovis también disminuyó considerablemente.

El resurgimiento de la TB en humanos en años recientes es atribuíble a M. tuberculosis. Hoy, con una tasa muy baja de TB bovina, la manera más eficiente de encontrar la enfermedad es a través de un programa nacional de vigilancia en establecimientos de sacrificio. Los inspectores de carne, estatales o federales, revisan las glándulas y órganos de los bovinos en búsqueda de signos de TB. Si estos inspectores encuentran lesiones sugestivas de infección por TB, se envían muestras de tejido a los laboratorios los Servicios Veterinarios Nacionales del APHIS, en Ames, Iowa, para su confirmación. Si el laboratorio confirma que las lesiones son resultado de TB bovina, se realiza una investigación exhaustiva con el fin de rastrear el ganado infectado desde los canales del mercado hasta el hato de origen, el cual se le realiza la prueba de tuberculina.

Si el hato de origen es diagnosticado con M. bovis, se realizan todos los esfuerzos posibles para eliminar a todos los animales del hato. Las indemnizaciones se pagan tanto como sea posible, para ayudar a los propietarios a compensar sus pérdidas. Si no es posible el despoblamiento del hato, se mantiene bajo cuarentena y se somete a pruebas reiteradamente hasta que se elimina toda evidencia de infección.

Los epidemiólogos veterinarios también intentan determinar la fecha probable en la que el hato se infecta. Se lleva a cabo un esfuerzo conjunto para rastrear a todo el ganado que se transportó hacia o desde un hato afectado, para intentar encontrar de dónde provino la enfermedad y hacia dónde pudo dirigirse.

Acreditación de área:

Para que un estado sea acreditado como libre de TB bovina, deben pasar al menos 5 años sin que se presente un solo caso confirmado de la enfermedad y el estado debe tener una serie de leyes de restricción y de regulaciones sobre los comerciantes de ganado. El estado debe mantener la vigilancia sobre el ganado en canales de mercado y requerir que se mantengan registros que permitan a los oficiales de salud animal el rastreo de animales infectados desde su origen.

Acreditación de hato

Los propietarios de ganado pueden obtener la condición de TB acreditada para sus hatos individuales siguiendo el “Plan de Acreditación de Hato”. Los detalles se encuentran en las publicaciones, “Métodos y Reglas Homologadas (M&RH) para Erradicación de la Tuberculosis Bovina” y “M&RH para la Erradicación de la Tuberculosis en Cérvidos”. Para que un hato califique como acreditado, deben mantenerse resultados negativos en dos pruebas anuales de TB para todo el ganado mayor de 24 meses y para el ganado de cualquier edad que no sea una adición natural al hato. Los venados y alces deben resultar negativos por tres años consecutivos.

To qualify and continue as an accredited herd, livestock must be tested annually within 10 to 14 months of the anniversary of the original test. Livestock from any herd in an accredited free State may be added to an accredited herd without a qualifying test.

Para calificar y continuar como hato acreditado, el ganado debe probarse cada año a partir del los 10 a 14 meses del aniversario de la prueba original. El ganado de cualquier hato es un estado libre acreditado puede agregarse a un hato acreditado sin necesidad de realizar ninguna prueba.

¿Qué puedes hacer?

Como productor ganadero- lechero, de carne, de venados o alces- hay ciertas cosas que puedes hacer para proteger a tus animales de la TB. La primera y la más importante de todas es saber que la TB no se ha ido. Muchos granjeros piensan erróneamente que la TB en el ganado ya ha sido erradicada. Recuerda que esta es una enfermedad crónica que continuará siendo una amenaza a la salud animal hasta que el último animal infectado sea eliminado.

Así, para estar seguro, haz un veterinario acreditado le practiquen pruebas de TB a tu ganado, a fin de asegurar que la enfermedad no se presenta en tu hato. Otros consejos para prevenir la infección por TB son las siguientes:

- Una de las mejores formas de evitar la TB – así como otras enfermedades- es mantener un hato cerrado. Esto supone que críes tus propios reemplazos. Si este sistema no es práctico para ti, exige que los comerciantes te entreguen un reporte del historial sanitario del hato de origen. Es mejor comprar a hatos acreditados como libres de TB.

- Si no puedes obtener historias clínicas, asegúrate que cualquier ganado a ingresar a tu hato sea probado antes de comprarlo. Que un veterinario acreditado aísle a estos animales y los mantenga bajo vigilancia durante 60 días.

- Mantén tus cercas en buen estado para evitar que tu ganado tenga contacto con animales vecinos.

- Y finalmente, coopera con los oficiales de sanidad animal, estatales y federales, que llevan a cabo las investigaciones de rastreo.

Para más información sobre TB bovina para copias de los M&RH, contacta:

Joseph S. Vantiem.

USDA, APHIS, Veterinary Services

Animal Health Programs

4700 River Road, Unit 36

Riverdale, MD 20737–1231

Teléfono (301) 734–6954

O visita nuestro sitio web en www.aphis.usda.gov/vs.

 

Okidoki, espero sirva de algo. Nos leeremos pronto

El Signo de La Espada: Tuberculosis bovina 3, Aspectos inmunológicos, lesiones y signos clíncos

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El Signo de La Espada: Tuberculosis bovina para estudiantes y profesionistas: diagnóstico, prevención y control

El Signo de La Espada: Tuberculosis bovina para estudiantes y profesionistas: diagnóstico, prevención y control

La tuberculosis bovina en imágenes.

Transmisión interespecie de la tuberculosis bovina. Se establecen las frecuencias de los mecanismos de transmisión.

Patogenia de la tuberculosis.



Vista a 40x (Hematoxilina y Eosina) de un típico centro necroso en una lesión tuberculosa en un nódulo linfático bovino, alrededor de la necosis se observa un infiltrado granulomatoso discreto rodeado de una fibrosis leve.


Vista a 40x de una lesión tuberculosa en un nódulo linfático bovino (Linfadenitis granulomatosa) con un centro necroso extenso en el cual se observan algunos sitios de calcificación. Alrededor se observan linfocitos y agregados de células epitelioides.
Nódulo linfático bovino. Hematoxilina Eosina 100x, detalle de una célula gigante que contiene esférulas de Coccidiodes immitis hongo que causa una lesión granulomatosa que puede confundirse a simple vista con tuberculosis bovina, la coccidiodomicosis es uno de los dianósticos diferenciales.

Detalle de una zona con infiltrado granulomatoso en un nódulo linfático bovino, se observan macrófagos epitelioides. 100X

Vista a 40x de una célula gigante de Langhans, tinción de Zhiel- Neelsen. Se observan bacilos ácido alcohol resistentes (BAAR) en el extremo inferior izquierdo de la célula.

El Doctor Guérin, Médico Veterinario de Maisons Alfort que fue co autor con el Dr. Calmette de la primera vacuna contra la tuberculosis, con una cepa de Mycobacterium bovis. El doctor Guérin se enfrentó a la tuberculosis muchas veces desde que tenía 10 años, cuando su padre murió de tuberculosis, posteriormente su esposa moriría de tuberculosis también. Jamás se volvió a casar. Durante la primer guerra mundial fue preso de los alemanes, ellos creían que enviaba mensajes con las palomas que utilizaba para experimentar. La primera vez que se probó la cepa de Calmette Guérin, muchos niños murieron, pero se debió a que utilizaron la cepa equivocada. Los esfuerzos de Guérin rindieron fruto cuando apartir de 1920 se empezó a utilizar en toda Francia la BCG y poco años después se propondría cada vez en más y más países.

El Doctor Robert Koch, el hombre que descubrió al bacilo causante de la tuberculosis, fue el primero en demostrar visualmente su existencia, porque logró teñirlo aplicando modificaciones a la tinción de Erlich, mismas que Zhiel y Neelsen había aplicado cada uno por separado. Fue duramente criticado por Virchow cuando propuso la utilización de la tuberculina como cura para la tuberculosis.


El Doctor Jean Antoine Villemin, un médico militar francés que para su desgracia fue ignorado por la comunidad científica durante décadas, pues no se le concedió el reconocimiento a su participación en la acumulación de conocimientos sobre la tuberculosis. A él se debe que se haya demostrado la transmisibilidad de la tuberculosis, así como la susceptibilidad de los animales a la enfermedad, de manera que en gran medida los postulados de Koch están relacionados a sus trabajos.


Gel de agarosa que muestra varias amplificaciones de ADN micobacteriano.


Tuberculosis bovina. Detalle de una célula gigante de Langhans.

Tuberculosis bovina, vista a 10x de un nódulo linfático bovino se observan células gigantes linfocitos y células epitelioides cercanas a un pequeño centro necrótico.



Medio de cultivo de Stonebrink, colonia disgónica de Mycobacterium bovis.


Fragmento de un nódulo linfático bovino fijado en formol, antes de su revisión y procesamiento histológico.

Extracción de una colonia de Mycobacterium bovis para su resiembra en medio de Stonebrink


Fragmentos de un nódulo linfático bovino antes de su procesamiento histológico.

Tuberculosis bovina, detalle de un centro necrótico.



Nódulo linfático bovino con un centro de necrosis caseosa rodeado por un infiltrado granulomatoso, células gigantes y un grupo numeroso de macrófagos. Esto puede sugerir un proceso de reinfección. Hematoxilina y eosina 10x


Vista 5x en H y E de un nódulo linfático bovino afectado de tuberculosis.

Mycobacterium bovis tinción de Zhiel- Neelsen de un frotis tomado de un macerado de tejido. vista a 100x


Mycobacterium bovis tinción de Zhiel- Neelsen de un frotis tomado de un macerado de tejido. vista a 40x


Gel de agarosa que muestra resultados de amplificación de ADN micobacteriano.


Mezclas de reacción en el momento en que se colocan en el termociclador


Preparación de la mezcla de reacción, se agrega Taq Polimerasa a la muestra de ADN.


Termociclador en el que se llevan a cabo las reacción de polimerasa.


Transiluminador en el que se visualizan las fluorecencias de los productos amplificados por PCR

Modelo tridimensional del conjugado proteico ESAT- 6:CFP- 10. Que se utiliza en el diagnóstico serológico de tuberculosis bovina.

Tuberculosis bovina, condiciones que afectan el diagnóstico por PCR

Saludos de nuevo, amigos veterinarios, esta vez decidí dedicarle un espacio para tratar con más detalles ciertos aspectos del diagnóstico de tuberculosis bovina mediante PCR. Aunque existen métodos moleculares más sofisticados como la PCR anidada, tipificación de oligo espaciadores (spoligotyping, espoligotipeo) análisis de restricción longitud del fragmento de polimorfismo (Restriction Fragment Length Polymorphism RFLP), PCR en tiempo real, PCR multiplex, Número Variable de Repeticiones en Tándem (que alguien me explique qué diablos es tándem) (Variable Number Tandem Repeat VNTR), estos métodos suelen aplicarse más a la investigación que al diagnóstico de rutina, consideremos que son demasiado costosos para ese uso. La PCR convencional está más al alcance de muchos laboratorios de diagnóstico. El siguiente texto también se desprende de mi trabajo de tesis y está enfocado a lo que puede pasar con la PCR cuando se utilizan muestras de tejido fijado en formol y embebido en parafina, comúnmente llamadas especímenes histológicos o muestras de archivo. Sin embargo, varias de esas condiciones también pueden aplicarse a tejidos en fresco o conservados en etanol al 70%.

Espero les sea de utilidad y gracias por atender esta fuente de información.

De nuevo la cita bibliográfica es:

Herrera, L. B. Comparación de histopatología, asilamiento bacteriológico y reacción en cadena de polimerasa simple en el diagnóstico de tuberculosis bovina. Tesis de Licenciatura, Universidad Autónoma de Chiapas


La variación de resultados de PCR puede esperarse en parte debido a las adaptaciones a la técnica de PCR, necesarias para adecuarla a las condiciones de cada localidad. Asimismo es posible enumerar diversas condiciones que pueden generar que se dañe el ADN o que no se amplifique. Entre tales condiciones se mencionan la insuficiencia del método de extracción de ADN como causa de falta de amplificación y se ha observado que mejorando los métodos de extracción, los resultados mejoran notablemente. Por otro lado, también se sabe que una posible inhibición de la actividad de la polimerasa es debida a la presencia de residuos de solventes utilizados en la preparación de los bloques de tejido.
La inhibición de la actividad de la polimerasa de ADN puede presentarse por la presencia de restos tisulares y ADN proveniente del tejido y en especial de restos de las paredes micobacterianas, que debido a la resistencia de las mismas, no fueron degradadas adecuadamente durante el proceso de extracción.
El mayor potencial de daño al ADN y por lo tanto a la amplificación es la fijación prolongada en formol, ya que este material causa fragmentación y enlaces cruzados en el ADN, eventualmente se pierden bases púricas lo cual conlleva a alineación inespecífica.
Al igual que el aislamiento bacteriológico, la PCR puede verse afectada por el bajo número de bacilos presentes,
Otro punto a considerar es el fragmento a amplificar. Mientras más copias de un fragmento existan en el genoma de un organismo, mayor es la probabilidad de amplificarlo.
El fragmento IS6110 está presente en la mayoría de las cepas de las especies pertenecientes al complejo M. tuberculosis, M. bovis posee como máximo tres copias del fragmento IS6110, la mayor parte de las cepas de M. bovis posee solo una copia de dicho fragmento. Asimismo se ha reportado la ausencia del fragmento IS6110 en diversas cepas de M. bovis.
La actividad del óxido nítrico y necrosis caseosa, como parte de la respuesta del hospedero, pueden ser factores potenciales de daño al ADN micobacteriano, disminuyendo la posibilidad de amplificar dicho ADN.

La distribución irregular de los bacilos en los bloques de tejido se menciona como una posible causa de disminución de la amplificación de ADN.
Todas estas condiciones, por sí solas o en conjunto disminuyen la posibilidad de amplificar el fragmento de ADN deseado, causando consecuentemente alteraciones de la validez del diagnóstico.
Por último, la persistencia de ADN de micobacterias en tejidos sanos durante infecciones latentes se ofrece como explicación a los falsos negativos.

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De nuevo la cita bibliográfica es:

Herrera, L. B. Comparación de histopatología, asilamiento bacteriológico y reacción en cadena de polimerasa simple en el diagnóstico de tuberculosis bovina. Tesis de Licenciatura, Universidad Autónoma de Chiapas

Tuberculosis bovina para estudiantes y profesionistas: diagnóstico, prevención y control

Saludos amigos, en esta entrada trataremos el diagnóstico de la tuberculosis bovina, mencionaremos varias técnicas diagnósticas que se pueden utilizar para esta enfermedad y detallaremos algunos aspectos del diagnóstico por histopatología, aislamiento bacteriológico y reacción en cadena de polimerasa simple, que son las técnicas más utilizadas. Espero que les resulte útil y que tengan la amabilidad de citarme:

Herrera, L. B. Comparación de histopatología, asilamiento bacteriológico y reacción en cadena de polimerasa simple en el diagnóstico de tuberculosis bovina. Tesis de Licenciatura, Universidad Autónoma de Chiapas.

Las páginas son:
Diagnóstico: 27- 42
Prevención y control: 42- 43

9. Diagnóstico.

Tuberculinización

La Norma Oficial Mexicana NOM-031-ZOO-1995 establece el uso de técnicas de campo, conocidas como pruebas de tuberculina. Se administran 0.1 mL de derivado purificado de proteína (PPD), de M. bovis por vía intradérmica en el pliegue caudal. Cuando un animal tuberculoso es expuesto por segunda vez al PPD desarrolla una respuesta de hipersensibilidad de tipo IV, mediada por linfocitos T específicos, de manera que se presenta una inflamación en el sitio de inyección, una zona elevada, enrojecida y endurecida que desaparece a medida que el antígeno se degrada. Se lee la prueba a las 72 horas y se interpreta como negativa, sospechosa o positiva dependiendo del tamaño de la zona inflamada. Todo animal reactor o positivo es sometido a la prueba de intradermorreacción cervical simple y de ser necesario se somete a la doble comparativa (o cervical comparativa) para la cual se utilizan los derivados purificados de proteína del M. bovis y M. avium. Se rasuran dos áreas de piel en el cuello del animal separados por 5 cm y se inyecta un PPD de M. bovis en un área rasurada y una PPD de M. avium en la otra la reacción es la misma que en la prueba de intradermorreacción en el pliegue caudal.

La prueba de tuberculina tiene como ventaja que es una prueba muy barata, pero posee algunas desventajas, entre ellas que a los animales que son inoculados no se les puede repetir la prueba hasta después de 60 días por anergia inmunológica inducida por la misma prueba. La eficacia de la prueba de tuberculina depende de factores tales como la potencia del PPD utilizado, la correcta aplicación y la capacidad de respuesta del animal infectado. En diferentes estudios en el campo se ha determinado una sensibilidad de la prueba entre el 77-95%. Falsos negativos ocurren en animales viejos, animales que han parido recientemente, animales en el estado inicial o final de la misma enfermedad, animales infectados con otros agentes patógenos ya sean estas infecciones virales, infecciones con otras micobacterias u hongos y algunas helmintiasis severas o en animales en estado caquéctico. La especificidad de la prueba en general es alta, alrededor de 98%, sin embargo, se han reportado valores entre el 75%-95%. Infecciones debidas a otras micobacterias del ambiente, así como bacterias de la familia Actynomicinae, interfieren con la prueba, debido a la existencia de antígenos comunes entre ellos.

Serología

La serología se utiliza para detectar el IFN-γ por medio de una Inmuno-ensayo ligado a enzimas (ELISA) indirecta en la que se incuba sangre completa de bovinos sospechosos de tuberculosis con un anticuerpo anti-IFN-γ. Si el animal ha estado en contacto con el microorganismo, sus linfocitos liberarán IFN-γ, el cual será detectado a través de ELISA, en el que los anticuerpos anti-IFN-γ capturan el IFN-γ bovino. Un anticuerpo específico anti-IFN-γ conjugado a una peroxidasa, reacciona produciendo color.

Posteriormente las placas en las que se lleva a cabo la reacción antes mencionada, se coloca en el espectrofotómetro de lectura de placas o lector de ELISA que mide la densidad óptica (DO) de la reacción. Una DO mayor a 0.100 se considera sospechosa y es positiva cuando supera los 0.300.

Es posible practicar la ELISA de IFN-γ utilizando un conjugado de ESAT-6:CFP-10, purificado o recombinante, o bien un conjugado ESAT-6:PPD-M, de manera que aumente la intensidad de la respuesta de IFN-γ, así como la sensibilidad y especificidad.

La técnica de ELISA de IFN-γ tiene ciertas vulnerabilidades, entre ellas que la intensidad de la reacción de IFN-γ se modifica de manera impredecible en animales con helmintiasis graves, aunque también se ha encontrado que la diferencia en reactividad entre animales se debe a la diversidad en los antígenos linfocitarios bovinos (BoLA) que existen en algunas razas. Una respuesta inmunosupresiva puede esperarse tras la inyección de PPD en varias ocasiones. Asimismo, el tipo de explotación a la que se somete al bovino puede afectar la lectura de la prueba, ya que estas representan diferencias en la exposición a un ambiente con micobacterias, siendo la producción tipo extensiva la que modifica en mayor grado la reacción de IFN-γ.

Asimismo la técnica de IFN-γ, al igual que la tuberculina puede presentar falsos positivos o cuando se presentan infecciones duales con otras micobacterias.

Recientemente se ha expuesto la necesidad de técnicas de campo más confiables, entre ellas el uso de cócteles peptídicos de ESAT-6 recombinantes conjugados con tuberculina, con el fin de mejorar la especificidad de la tuberculina, y además detectar animales recientemente infectados. Generalmente los conjugados antigénicos se utilizan para evaluarse posteriormente con ELISA de IFN-γ. La respuesta de ON y TNF-α también son detectadas por ELISA y por inmunoblot. La detección de TNF-α junto a la de IFN-γ pueden mejorar la especificidad más que la detección de ON, dado que esta respuesta es variable según la raza del animal infectado y la cepa infectante.

Otra técnica propuesta es la aglutinación en gotas de látex. Esta técnica consiste en agregar el antígeno ESAT-6 a gotas de látex, cubiertas por una solución de sujeción de fosfatasa alcalina. Estas gotas se exponen a suero bovino, si este contiene la IgG específica de ESAT-6 esta se aglutinará con la gota de látex impregnada con el antígeno.

La técnica más recientemente descrita es la conocida como inmunocromatografía o técnica de flujo lateral, cuyo uso se propone para la detección de respuestas séricas de MP83, MP70, ESAT-6 y CFP-10. Esta técnica utiliza una modificación de la aglutinación en gotas de látex. Por fuerzas capilares, los complejos de aglutinación fluyen lateralmente a través de las membranas de nitrocelulosa impregnada de antígeno, fijando el antígeno inmovilizado en las gotas de látex de manera que se produce una banda de color azul.

Examen directo.

Consiste en centrifugar líquidos corporales (aspirados torácicos, abdominales, orina, exudados traqueobronquiales). Si el exudado es fibrinoso, se pasa a digestión con hidróxido de sodio al 0.4% estéril durante 45 minutos. Posteriormente se desinfectan con hipoclorito de sodio para eliminar microorganismos que no sean micobacterias. Los frotis del sedimento o los tejidos se tiñen con colorantes acidorresistentes (Ziehl- Neelsen) o con auramina- rodamina cuando se dispone de microscopio de fluorescencia. La muestra se considera positiva cuando se encuentran más de diez bacilos por campo.

Inspección en rastro.

Los animales positivos a las diferentes pruebas de tuberculinización o, en dado caso, a la prueba de IFN-γ, son marcados con una T en la mejilla izquierda y se sacrifican al final de la jornada. En ciertos casos pueden encontrarse animales negativos a las técnicas de campo convencionales, con lesiones sospechosas. Estas lesiones pueden ser discretas y focales con necrosis y exudado purulento o lesiones graves, difusas con exudado caseoso amarillento y diversos grados de calcificación. Todas las lesiones sospechosas se envían a los laboratorios de diagnóstico animal en dos partes: una porción laminada y contenida en formol al 10% en una proporción de 1:10 y otra mitad no laminada en borato de sodio en proporción 1:1.

Histopatología y aislamiento.

Los tejidos con lesiones sospechosas, principalmente nódulos linfáticos y pulmones, se envían en formol al 10% a laboratorio en proporción 1:10. Se realiza el corte con microtomo y la tinción del tejido fijado con Hematoxilina-Eosina y Ziehl-Neelsen, posteriormente se analizan los tejidos con microscopía óptica. Puede observarse fibrosis, zonas necróticas claramente definidas, células gigantes con núcleos en formación semilunar o de herradura, zonas de calcificación. En los cortes teñidos con Ziehl-Neelsen se observan bacilos ácido-alcohol resistentes de color rojo magenta. Se describen como negativo, compatible o sugestivo dependiendo de los hallazgos.

De acuerdo a la Norma Oficial Mexicana NOM 031- ZOO- 1995, el diagnóstico por histopatología debe confirmarse por bacteriología, las muestras deben llegar al laboratorio en un frasco de boca ancha inmersas en borato de sodio en proporción 1:1. Las muestras no deben estar laminadas ni con sangre y de preferencia sin tejido adiposo. El aislamiento bacteriológico se realiza en un medio como el Stonebrink e incubadas a 37° C durante 9 semanas. La tipificación se realiza con resiembras de las colonias aisladas en medio de Stonebrink, estas resiembras se someten a temperaturas de 22, 37 y 45° C y posteriormente se realizan pruebas bioquímicas como catalasa, nitrato y niacina.

Condiciones que afectan el estudio histopatológico.

Entre estos el más frecuente es que la muestra no se remita al laboratorio con un laminado adecuado, esto puede dificultar que la muestra se fije bien y causa algunos problemas en el procesamiento histológico. Otra condición de importancia es el tiempo que transcurre entre el momento en que se toma la muestra y el que se coloca en formol. Si la cantidad de formol no se presenta en la proporción 1:10 ni en la concentración necesaria, el tejido no se fijará adecuadamente. Todo lo anterior genera cambios de importancia en el tejido que alteran la lectura de las laminillas.

Condiciones que afectan el aislamiento bacteriológico.

Una mala proporción de conservador representa un problema frecuente. Si la proporción de borato de sodio es menor a la de la muestra, podría disminuir la viabilidad del bacilo, es sufre un proceso de desvitalización.El aislamiento bacteriológico es muy vulnerable a la contaminación de las muestras, dado que se presenta una competencia entre el M. bovis y otros microorganismos, particularmente si desde que la muestra fue enviada, esta contiene pelo, sangre o heces. La cronicidad o la severidad de las lesiones también generan problemas al aislamiento bacteriológico. Si la proporción de borato es mayor, esto causa un grado mayor de deshidratación del tejido, en especial si la muestra está laminada. Cualquiera de las situaciones antes mencionadas genera condiciones que disminuyen la viabilidad del bacilo. Además el aislamiento bacteriológico puede verse vulnerado por la calidad del huevo que se utiliza como ingrediente del medio de Stonebrink, el huevo debe ser fresco y de preferencia de gallina de traspatio a fin de evitar inhibición de crecimiento, debido a que a estas gallinas no se les administran antibióticos.

Cromatografía Líquida de Alto Rendimiento.

La técnica de Cromatografía Líquida de Alto Rendimiento examina el tiempo de elución y retención relativa de los ácidos micólicos. Para ello se requiere la saponificación de estos ácidos. Los ácidos micólicos se visualizan con rayos ultravioleta a 254nm de longitud de onda.Con esta técnica M. bovis presenta elución en 5 minutos con 35 segundos.

Cromatografía Líquida en Capa Delgada.

Los ácidos micólicos son α- alquil, β - hidroxiácidos de alto peso molecular, que se encuentran en la pared celular como componentes característicos de las micobacterias. La técnica de Cromatografía en capa delgada consiste en extraer los ácidos micólicos de colonias cultivadas. Con esta técnica se detecta un patrón característico de M. bovis, que incluye α- micolatos, metoximicolatos y cetomicolatos, este patrón difiere del patrón de M. tuberculosis dado que carece de hidroximicolatos.

Reacción en Cadena de Polimerasa.

La PCR utiliza el fenómeno de replicación semi conservativa del ADN y la repite bajo condiciones específicas hasta obtener una o varias secuencias específicas de nucleótidos “ millones de veces. Es necesario extraer el ADN de las muestras de tejido, macerando las muestras y posteriormente someterlas a proteólisis. El ADN se purifica y se mezcla con “iniciadores” o “primers” que son secuencias sintéticas de hebra sencilla, de hasta 30 nucleótidos. Cuando el ADN se desnaturaliza, las porciones de ADN que sean las mismas bases nitrogenadas que los iniciadores, si las hay, se aparearán con estos iniciadores, de manera que se forman millones de secuencias específicas de ADN. El primer paso es conocido como desnaturalización del ADN el cual se lleva a cabo a 95° C. Posteriormente se realiza la alineación, en el cual los inciadores y las secuencias de nucleótidos que les corresponden se encuentran y se alinean o aparean, la temperatura necesaria para alinear (temperatura de apareamiento o Tm) los iniciadores varía y es específica para cada iniciador y puede variar desde 60 a 68° C, este pasos debe repetirse desde 15 hasta 90 veces dependiendo de la eficiencia del proceso y del iniciador. El último paso, denominado extensión que se realiza a 72° C, en el que se alargan los inciadores y se exponen las bases nitrogenadas y se unen en el orden necesario. El producto de PCR se coloca sobre un gel de agarosa previamente teñido con bromuro de etidio y se somete a electroforesis. Las secuencias se movilizan atraídas por la electricidad, moviéndose a una cierta distancia dependiendo de su peso molecular, se agrupan y se observan en una cámara de luz ultravioleta. Si aparecen las marcas de las secuencias de nucleótidos y encajan con las marcas que producen los iniciadores, se lee como positivo, pues la especie que se busca se manifiesta.

La secuencia de inserción (IS) 6110 se utiliza ampliamente para detectar a las especies del complejo Mycobacterium tuberculosis debido a que presenta un alto grado de conservación entre las micobacterias del complejo M. tuberculosis. Además de que el tamaño de este segmento de inserción, 125 pares de bases, puede facilitar su amplificación cuando las muestras clínicas son expuestas a condiciones que fragmentan el ADN.

Sin embargo la amplificación de esta secuencia de inserción puede dar lugar a la detección de más de una especie de micobacteria. Por esta razón se amplifican por PCR las regiones oxyR y pncA, que presentan un polimorfismo en la región 285 y 169 respectivamente, lo que puede ser útil para diferenciar M. bovis de M. tuberculosis. De igual manera el fragmento mtp40 puede estar ausente en algunas cepas de M. tuberculosis y causar un falso positivo si existiera una muestra infectada una de estas cepas. Para evitar esto y a la vez discriminar de M. avium, M. microti y M. africanum se utiliza la amplificación de un gen de 500 pares de bases de la región oxyR con los iniciadores JB 21 y JB 22. La región oxyR codifica proteínas relacionadas con la resistencia al estrés oxidativo y los iniciadores JB 21 y JB 22 se diseñaron para ser altamente específicos para M. bovis.

Diagnóstico diferencial.

Varias enfermedades se pueden confundir con tuberculosis, sobre todo en el rastro debido a similitudes en las lesiones, entre ellas destacan: actinobacilosis, actinomicosis, nocardiosis, paratuberculosis, criptococosis, coccidiodomicosis e histoplasmosis, así como neoplasias, particularmente carcinomas y adenomas.

La nocardiosis puede diferenciarse de tuberculosis por M. bovis mediante la observación al microscopio porque Nocardia asteroides es más corto que el M. bovis y además es Gram positivo. Asimismo N. asteroides forma hifas rudimentarias o filamentos ramificados que se fragmentan en formas cocoides y bacilares, mientras que M. bovis forma filamentos o cordones. Otras técnicas para diagnóstico diferencial incluyen la fijación de complemento, Inmunodifusión en gel de agar (AGID) y ELISA.

La actinomicosis se puede diferenciar de la tuberculosis por medio de histopatología porque la lesión principal es un piogranuloma, en la que los neutrófilos se encuentran al centro de la necrosis y están rodeados por macrófagos. Además se presentan estructuras bacterianas radiadas eosinofílicas intralesionales negativas a Zielh-Neelsen y Gram positivas. Otras técnicas para diagnosticar esta enfermedad son: aislamiento bacteriológico, inmunohistoquímica, seroaglutinación, fijación del complemento, inhibición de la hemoaglutinación, neutralización de la toxina y AGID.

La actinobacilosis se puede diferenciar de tuberculosis con histopatología por características muy similares a las que causa Actinomyces bovis. Asimismo la actinobacilosis se caracteriza por presentar una extensa fibrosis, notablemente mayor a la que se presenta en la tuberculosis bovina.

Cryptococcus neoformans puede diferenciarse por histopatología porque se observan macrófagos vacuolados que contienen cuerpos levaduriformes, ovoides o esféricos de 5 a 10 μm, de pared gruesa. Estas estructuras se evidencian mejor por la tinción de Ácido Peryódico de Schiff (PAS) o Grocott. Asimismo, también se observan grupos de neutrófilos alrededor de los cuerpos levaduriformes libres en el tejido.

A su vez, las lesiones causadas por Histoplasma capsulatum cuando se observan al microscopio, suelen presentar un alto grado de calcificación, así como fibrosis que se distribuye de manera concéntrica alrededor del foco necrótico, formando un granuloma bien definido.

Dentro de algunos macrófagos pueden observarse estructuras redondas y pequeñas, de 2 a 4 μm con la zona central teñida, con un halo alrededor que parece encapsularlas. Se observan mejor con PAS o Grocott

Las lesiones causadas por Coccidiodes immitis se observan al microscopio como piogranulomas similares a los que se presentan en actinobacilosis/actinomicosis, pero se pueden observar las esférulas del hongo, las cuales miden cerca de 50 μm y las características como endosporas y ausencia de gemas se evidencian por tinción de PAS.

Algunas neoplasias como adenomas, adenocarcinomas y linfomas se remiten con frecuencia a los laboratorios para su diagnóstico, sospechándose de lesiones tuberculosas, dado que algunas neoplasias macroscópicamente presentan aspecto granuloso, endurecimiento o calcificaciones y necrosis caseosa. Un adenoma es una neoplasia epitelial benigna que deriva de una glándula aunque no necesariamente repite los patrones glandulares. Puede observarse formando patrones glandulares muy estrechos similares a los de la glándula original pero con una orientación distinta.

10. Prevención y control.

En todos los países en los que la tuberculosis bovina se presenta, se implementan programas enfocados principalmente a evitar la diseminación de la enfermedad entre regiones y entre rebaños. Una de las medidas más socorridas es la detección de la tuberculosis bovina por medio de tuberculinización, el aislamiento de los animales enfermos y la restricción de transporte de estos, cuando se realizan programas de detección previas al traslado, en México estas actividades estás reglamentadas por la NOM- 031- Z00- 1995. Otra medida de control es impedir la entrada de animales de una zona con presencia de tuberculosis a una zona libre. Se exige que, en la compra de bovinos, se extienda al comprador un certificado de hato libre, en el cual se documente que a los bovinos les fue practicada una prueba de tuberculina que resultó negativa. El ejemplar que ingresa a un nuevo rebaño debe cuarentenarse y ser sometido a nuevas pruebas, el nuevo ejemplar debe eliminarse o mantenerse aislado a fin de evitar el contagio si resulta positivo a tuberculosis. La confirmación diagnóstica de los casos de tuberculosis bovina se utiliza para determinar las prevalencias locales o regionales y con base en esos datos establecer modificaciones especiales a los programas de control, por ejemplo, intensificar las campañas de tuberculinización y de concientización a los productores, así como mejorar las técnicas de diagnóstico. En algunos países de Latinoamérica, en respuesta a los planteamientos de la Oficina Internacional de Epizootias (OIE), se implementaron programas de semi despoblamiento de los rebaños, mientras que en otros se ordena el despoblamiento total y la cuarentena obligatoria por seis meses.

En algunos países, la presencia de una amplia gama de reservorios silvestres representa un riesgo de infección para los hatos ganaderos, sobre todo para aquellos que pastorean en grandes extensiones en sistemas silvopastoriles. En estos países se han puesto en marcha programas que recomiendan el uso de dispositivos mecánicos que ahuyenten a ciertas especies como alces y venados, a fin de que no contaminen los pastizales que sirven de alimento al ganado bovino o bien, que hagan uso de repelentes químicos a fin de simular un marcaje de territorio para que no se acerquen mamíferos pequeños como mapaches, hurones, comadrejas y otros mustélidos que se conocen como reservorios de M. bovis. Estos programas incluyen la vacunación de grandes masas de reservorios silvestres con cepas atenuadas o del bacilo de Calmette-Guérin (BCG), ya que en los animales vacinados con estas cepas, la excresión por vía fecal del bacilo disminuye .

Por su parte en países que tienen condiciones ambientales muy adversas, tales como sequías prolongadas que obligan a que las personas compartan las fuentes de agua con los animales, situaciones que dificultan en gran medida el control y la erradicación de la tuberculosis bovina, se ha propuesto el uso de la vacunación del ganado bovino con cepas de BCG para el control a largo plazo de la tuberculosis bovina, ya que esta vacuna disminuye la eliminación del bacilo en las heces. No obstante, en el ganado bovino vacunado las pruebas de tuberculina presentan un índice mayor de falsos positivos, de tal manera que en vez de pruebas de PPD, los veterinarios se verían obligados a utilizar agentes diagnósticos más precisos como el conjugado peptídico de ESAT- 6:CFP- 10 y la prueba de INF- γ para diferenciar entre la infección con M. bovis y la vacunación con M. bovis BCG. Además, se ha comprobado que la revacunación del ganado bovino con BCG disminuye la protección.

La referencias bibliográficas las voy a colocar en la próxima entrada, en la que hablaremos acerca de las condiciones que afectan el diagnóstico por PCR.